簡(jiǎn)要描述:基因組DNA抽提,可以抽提動(dòng)物組織、鼠尾、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、動(dòng)物血液、昆蟲以及固定組織的包括基因組DNA在內(nèi)的總DNA。通過試劑盒說明書中提供的不同操作方法,幾乎可以抽提所有樣品中的總DNA。
基因組DNA抽提:
通過基因組DNA抽提試劑盒可以抽提動(dòng)物組織、鼠尾、培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、動(dòng)物血液、昆蟲以及固定組織的包括基因組DNA在內(nèi)的總DNA。通過試劑盒說明書中提供的不同操作方法,可以抽提除植物樣品外的幾乎所有樣品中的總DNA。
步驟:
樣品首先被蛋白酶K消化,隨后加入適合DNA結(jié)合到純化柱上的緩沖液,然后加入到純化柱內(nèi)。通過高速離心,使DNA在穿過純化柱的瞬間,結(jié)合到純化柱上,隨后通過兩次洗滌去除各種雜質(zhì),zui后通過洗脫液把DNA洗脫下來。整個(gè)過程無需酚氯仿抽提,無需酒精沉淀,樣品裂解后僅需約15分鐘即可完成。
效率:
1. 通過試劑盒純化得到的基因組DNA的長(zhǎng)度zui長(zhǎng)可達(dá)50kb左右,平均為30kb左右,zui短為100bp的DNA也可以被純化。如需獲得更長(zhǎng)的基因組DNA,對(duì)于哺乳動(dòng)物樣品,包括組織或細(xì)胞等,可以使用特定的試劑盒抽提。
2.通過試劑盒獲得的總DNA,OD260/OD280的范圍通常在1.7至1.9之間。
3.試劑盒可以抽提少至數(shù)百個(gè)細(xì)胞,多至25mg組織、0.5-1cm鼠尾、500萬個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞、20億個(gè)細(xì)菌或5000萬個(gè)酵母。
4.樣品用量過多,反而會(huì)影響抽提效果。如果待抽提樣品的DNA含量小于5ng,建議加入適當(dāng)量的carrier DNA,例如poly-dT或其它對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒有干擾的DNA,也可以加入適當(dāng)量的carrier RNA,例如yeast RNA等,以改善抽提效果。
5.試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟抽提得到的總DNA會(huì)含有少量RNA,但如果按照一般的試劑盒可選步驟加入RNase A,就可以獲得不含RNA的高純度總DNA。含有RNA的總DNA可以用于PCR,但對(duì)于某些其它的后續(xù)反應(yīng)可能會(huì)產(chǎn)生一些影響。
DNA抽提時(shí)樣本抽提的范圍:
純化柱對(duì)于DNA的zui大容量約為30微克。通常每200萬Hela細(xì)胞或500萬淋巴細(xì)胞可以抽提得到15-25微克總DNA,每25mg肝、腦、腎組織可以抽提得到10-30微克總DNA,每25毫克心、肺組織可以抽提得到5-10微克總DNA,每10mg脾組織可以抽提得到5-30微克總DNA,每1.2cm小鼠尾尖或0.3cm大鼠尾尖可以獲得10-25微克總DNA。
DNA抽提小量試劑盒包裝清單:
產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
D-1 | 樣品裂解液A | 10ml |
D-2 | 樣品裂解液B | 11ml |
D-3 | 洗滌液I | 21ml (*次使用前加入7ml無水乙醇) |
D-4 | 洗滌液II | 16ml (*次使用前加入24ml無水乙醇) |
D-5 | 洗脫液 | 22ml |
D-6 | 蛋白酶K | 1.1ml |
— | DNA純化柱 | 50個(gè) |
— | 廢液收集管 | 50個(gè) |
— | 說明書 | 1份 |
保存條件:
蛋白酶K-20℃保存,其余均室溫保存。一年有效。蛋白酶K室溫(15-25℃)存放一周,活力無明顯下降。
DNA抽提注意事項(xiàng):
1.抽提細(xì)菌、酵母樣品時(shí)還需要一些特定的試劑,詳情請(qǐng)參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟。
2.如需制備不含RNA的高純度總DNA,需自備RNase A。
3.溫度較低時(shí)樣品裂解液A或樣品裂解液B中可能會(huì)有沉淀產(chǎn)生,屬正?,F(xiàn)象。使用前必須檢查一遍。如有沉淀,55℃水浴孵育使沉淀溶解,混勻后使用。
4.*次使用前洗滌液I需添加7ml無水乙醇,洗滌液II需添加24ml無水乙醇,混勻,并在瓶上做好標(biāo)記。
5.試劑盒需使用55℃水浴,請(qǐng)?zhí)崆白骱脺?zhǔn)備。
6.除特別說明外,每次Vortex應(yīng)控制在5-10秒左右。
7.試劑盒所有操作均在室溫進(jìn)行,操作時(shí)無需冰浴。所有離心也均在室溫進(jìn)行。
8.廢液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丟棄。
9.參考使用說明,從某些樣品中抽提總DNA不需要使用樣品裂解液A。
10.為了您的安全和健康,請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。