實時熒光定量PCR（Real Time Quantitative PCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。相對定量用于測定一個測試樣本中目標(biāo)核酸序列與校正樣本中同一序列表達的相對變化。校正樣本可以是一個未經(jīng)處理的對照或者是在一個時辰研究中處于零時的樣本。

相對定量應(yīng)用（Relative Quantification，RQ）

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBR Green

   SYBR Green特性：

（1）只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。

（2）變性時，DNA雙鏈分開，無熒光。

（3）在延伸結(jié)束階段采集熒光信號。

（4）SYBR Green也能和非特異性的雙鏈DNA結(jié)合發(fā)光，所以必須在反應(yīng)結(jié)束時做熔解曲線分析。

相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量：
內(nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因，在細胞中的表達量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小，內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細胞或基因組數(shù)量。

相對定量分析方法：

2-ΔΔCt
前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計算表達水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達量的比值

服務(wù)流程：

注意：客戶可根據(jù)所能提供的起始材料不同，選擇從步驟1或2啟動項目。