淺析慢病毒載體

慢病毒載體介紹

    慢病毒載體（ Lentiviral vector, LVs ）是在 HIV-1 病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能的將目的基因（或 RNAi ）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA ，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為 DNA ，形成 DNA 整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后， DNA 整合到細(xì)胞基因組中。整合后的 DNA 轉(zhuǎn)錄 mRNA ，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生 RNAi 干擾。

    慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或 RNAi 干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長(zhǎng)期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

    慢病毒載體不表達(dá)任何 HIV-1 蛋白，免疫原性低，在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響病毒載體的第 2 次注射。

 

慢病毒載體的構(gòu)建

1. 構(gòu)建原理

   慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，但其基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除 gag、pol 和 env 這 3 個(gè)和單純逆轉(zhuǎn)錄病毒相似的結(jié)構(gòu)基因外，還包括 4 個(gè)輔助基因，vif、vpr、nef、vpu 和 2 個(gè)調(diào)節(jié)基因 tat 和 rev 。 HIV 21 是慢病毒中特征性的病毒，*個(gè)慢病毒載體系統(tǒng)即以此病毒為基礎(chǔ)進(jìn)行構(gòu)建的。慢病毒載體的構(gòu)建原理就是將 HIV 21 基因組中的順式作用元件 （ 如包裝信號(hào)、長(zhǎng)末端重復(fù)序列 ） 和編碼反式作用蛋白的序列進(jìn)行分離。載體系統(tǒng)包括包裝成分和載體成分：包裝成分由 HIV 21 基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的 HIV 21順式作用序列。

    同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒 （RCV ） 的可能性，將包裝成分的 5 ′ LTR 換成巨細(xì)胞病毒 （CMV ） 立即早期啟動(dòng)子，3 ′ LTR 換成 SV 40 polyA 位點(diǎn)等。將包裝成分分別構(gòu)建在兩個(gè)質(zhì)粒上，即一個(gè)表達(dá) gag 和 pol、另一個(gè)表達(dá) env 。根據(jù)這個(gè)原理，Naldini 和 Kafri 等構(gòu)建了三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)。

2. 三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)

    三質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括包裝質(zhì)粒、包膜蛋白質(zhì)粒和轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。其中包裝質(zhì)粒在 CMV 啟動(dòng)子的控制下，表達(dá) HIV 21 復(fù)制所需的全部反式激活蛋白，但不產(chǎn)生病毒包膜蛋白及輔助蛋白 vpu；包膜蛋白質(zhì)粒編碼水泡性口炎病毒 G 蛋白 （V SV 2G），應(yīng)用 VSV 2G 包膜的假構(gòu)型慢病毒載體擴(kuò)大了載體的靶細(xì)胞嗜性范圍，而且增加了載體的穩(wěn)定性，允許通過高速離心對(duì)載體進(jìn)行濃縮，提高了滴度； 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒中除含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄及整合所需的順式序列，還保留 350 bp 的 gag 和 RRE，并在其中插入目的基因或標(biāo)志基因 （ 綠色熒光蛋白 GFP） 。將載體系統(tǒng)分成三個(gè)質(zhì)粒zui大的益處是使序列重疊的機(jī)會(huì)大大減少，減少載體重組過程中產(chǎn)生 RCV 的可能性。通過三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞，超速離心后病毒滴度可達(dá) 109IU /m l 。

3. 四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)

    為了減少 HIV 21 包裝結(jié)構(gòu)的序列同源性，進(jìn)一步減少重組成 RCV 的可能性，Dull 等人將輔助基因去除。但由于 gag2pol 的轉(zhuǎn)運(yùn)需要 rev，因此，在上述的三質(zhì)粒系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建成四質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)加上含 rev 的質(zhì)粒減少了產(chǎn)生 RCV 的可能性，而且對(duì)非分裂期細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率無影響。

 

慢病毒載體應(yīng)用

1. 將目的基因 /RNAi 基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞；

2. 將目的基因 /RNAi 基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物組織，以期獲得長(zhǎng)期表達(dá)；

3. 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白 /RNAi 的細(xì)胞系，再用exvivo的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)；

4. 基因治療；

5. 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；

6. 基因敲除；

7. 藥物研究：構(gòu)建表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞系，研究藥物的作用；

8. 快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核細(xì)胞表達(dá)方法。

 

    慢病毒（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、干細(xì)胞等多種類型的細(xì)胞，從而達(dá)到良好的的基因治療效果，在美國(guó)已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應(yīng)用前景。